STAR Protocols丨汤常永团队发表基于慢病毒调控基因表达评估成年啮齿动物神经发生和认知功能的实验方案
成体神经发生是神经干细胞（Neural stem cells, NSCs）产生功能性新生神经元的过程，其主要发生在海马齿状回(Dentate gyrus, DG)的颗粒细胞层下区和侧脑室下区[1]。其中，成体海马神经发生（Adult hippocampal neurogenesis, AHN）异常被认为是导致神经退行性疾病和神经精神性疾病认知功能障碍关键因素[1-2]。目前，各种研究成体神经发生异常的分子机制方法迥异，不能统一评估和有效复制；因此，急需建立一套相对完整、高效和简洁的标准化研究方案。
2023年11月28日，红宝石活动优惠大厅hbs（以下简称：中山三院）汤常永团队受邀在Cell子刊STAR Protocols在线发表了题为“Protocol for lentivirus-mediated delivery of genes to study neurogenesis and cognitive function in adult rodents”的实验方案文章（Protocol）。该文章展示了一套相对完整的实验流程，包括构建包装含有目标基因（多效生长因子[Pleiotrophin, PTN]）的慢病毒，利用脑立体定位注射技术向海马齿状回注射慢病毒，评估海马成体神经发生，以及实施认知功能相关行为学测试。这一实验流程为该领域科研人员研究AHN的分子机制提供一种简洁且系统的实验方案。此前，汤常永团队已运用本实验方案进行了衰老相关的海马神经发生衰退及相关认知功能障碍分子机理的研究，相关研究成果发表于Cell Reports (2023)[3]。
△原文链接 https://doi.org/10.1016/j.xpro.2023.102761
参考文献
1.Li, Y., et al. Neural Stem Cell Niche and Adult Neurogenesis. Neuroscientist. 2021; 27: 235–245.
2.Anacker, C., et al. Adult hippocampal neurogenesis and cognitive flexibility - linking memory and mood. Nat. Rev. Neurosci. 2017; 18: 335–346.
3.Li H, et al. Pleiotrophin ameliorates age-induced adult hippocampal neurogenesis decline and cognitive dysfunction. Cell Rep. 2023;42(9):113022.
论文梗概
在本研究方案中，作者以PTN为例，详细阐述了PTN过表达慢病毒构建、海马DG区立体定位注射、神经发生评估（EdU和BrdU注射）、组织免疫荧光处理和认知行为学测试的实验流程（图1）。
△图1：神经发生相关动物体内实验方案流程图（图源: Xu, et al., STAR Protoc. 2023）
作者首先详细描述了过表达PTN慢病毒的构建方法，即：使用目标质粒CAG-PTN-2A-GFP和3个包装质粒（VSVG，pMDLg和pRSV-Rev）按一定比例混合后，利用转染试剂聚乙烯亚胺（Polyethylenimine， PEI)，以HEK293T细胞为媒介，依次通过连续收集含有病毒的细胞培养基上清、负压过滤、超速离心、病毒滴度测定等步骤，构建过表达PTN的高滴度慢病毒（图2）。
△图2：过表达PTN慢病毒构建示意图（图源: Xu, et al., STAR Protoc. 2023）
然后，通过查阅相关资料，确定小鼠海马DG区坐标：以前囟为0点，向后2.0 mm，中线旁开1.7 mm，深度1.9 mm；利用小动物气体麻醉机对老年小鼠（12月龄）进行诱导麻醉和维持麻醉，再将小鼠固定于操作台，剔除头部毛发后使用数字化立体定位仪标记坐标；完成以上术前准备后，使用颅钻打孔，通过显微注射器匀速注入慢病毒后留针5分钟，接着缝合伤口完成整个海马DG区的病毒注射；最后将术后小鼠置于小动物电热毯进行麻醉复苏，密切关注小鼠生命体征，待小鼠舒醒后，放回干净鼠笼（图3）。
△图3：成年小鼠海马齿状回慢病毒立体定位注射的主要手术器械和关键步骤（图源: Xu, et al., STAR Protoc. 2023）
接着，将一批老年小鼠在术后1周取材前2小时进行腹腔注射EdU，从而标记具有增殖能力的NSCs，以评估过表达PTN对NSCs增殖能力（GFP+EDU+GFAP+细胞）的影响。同时，手术3天后对另一批老年小鼠进行连续4天的腹腔注射BrdU来标记NSCs，然后分别在第2周末和第4周末对小鼠进行取材，通过组织免疫荧光染色对比过表达PTN组小鼠和对照组小鼠海马区的新生未成熟神经元（GFP+BrdU+DCX+细胞）和新生神经元（GFP+BrdU+NeuN+细胞）的数量，进而反映过表达PTN能够提高NSCs向神经元分化的潜能（图4）。
△图4：PTN能够促进成年小鼠海马区NSCs的增殖和神经元向分化（图源: Xu, et al., STAR Protoc. 2023）
最后，在术后4周时，对2组剩余的老年小鼠进行认知功能相关行为学测试，包括传统水迷宫（Morris Water Maze, MWM）实验和反向水迷宫（Reverse Morris Water Maze, RMWM）实验，分别比较2组小鼠找到平台的潜伏期和穿越目标象限的次数；结果表明，过表达PTN组的小鼠总体表现更好，提示PTN能够改善老年小鼠的认知功能减退（图5）。
△图5：PTN能够改善年龄相关的认知功能减退（图源: Xu, et al., STAR Protoc. 2023）
结论与讨论
综上所述，在这项工作中，作者详细描述了一套评估动物体内神经发生的系统性实验流程。通过构建载运目标基因的慢病毒，靶向海马DG区进行立体定位注射，借助EdU和BrdU方法标记NSCs，利用免疫荧光检测海马DG区组织等有效评估了特定基因对AHN的关键作用；同时，辅以行为学测试，进一步从功能学层面揭示了目标基因的具体影响。该方法有利于全面评估AHN，为研究AHN的分子机制提供了标准化实验方案。
研究团队
中山三院徐莉博士研究生为本文第一作者，汤常永为通讯作者；该研究得到了中山三院李浩洋、姜维、徐辉明等同学的帮助。此外，该研究得到了中山三院神经内科陆正齐、邱伟，实验医学部韩晓燕及丘秀生等教授的支持和帮助。
△照片提供自汤常永团队
通讯作者简介：汤常永，红宝石活动优惠大厅hbs副研究员，中山大学“百人计划”引进人才。2019年毕业于中国科学院遗传与发育生物研究所并获得神经生物学专业博士学位，布朗大学博士后。曾获得北京市优秀毕业生、中科院优秀毕业生、中科院院长优秀奖等奖励。主要研究神经干细胞和星形胶质细胞及其微环境在神经退行性疾病（如衰老、AD等）和神经免疫性疾病（如NMOSD、MS等）中的作用。近年来在Science Advance (2023)，Molecular Therapy (2023)，Cell reports (2023, 2019)，Neuron (2019)，Molecular Psychiatry (2021)，Glia (2022), STAR Protocols (2020, 2023)等杂志发表多篇学术论文，并主持国家自然基金、科技创新-2030脑计划青年项目（课题骨干）、广州市基础与应用基础科学基金等多个科研项目。
